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發光標記物吖啶酯(NSP-SA-NHS)如何標記抗體

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發光標記物吖啶酯(NSP-SA-NHS)如何標記抗體

2021/03/10 13:30
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吖啶酯(NSP-SA-NHS,Cas199293-83-9及其相關化合物已被證明是非常有優勢的化學發光標記物,其穩定性、活性和敏感性超過了某些放射性同位素。吖啶酯能與含有一級氨基的蛋白發生反應。在堿性條件下,NHS作為離去基團被取代,蛋白質與吖啶酯形成穩定的酰胺鍵。反應完成后,多余的吖啶鹽通過脫鹽柱除去,下面介紹下NSP-SA-NHS使用說明(舉例抗體/蛋白質標記)。

1.配制   

標記緩沖液:0.2M NaHCO3  (pH=9.0);

標記終止緩沖液:10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液;

脫鹽純化緩沖液:0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5);

吖啶酯發光液:(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

2. 計算標記所用抗體(蛋白質)和吖啶酯的量:

通常設定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50,具體需根據氨基酸組分進行摸索調整;

配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液,注意玻璃器皿盛放并避光;

使用0.2M NaHCO3pH=9.0 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應液 。

3. 連接及純化

本說明書舉例針對標記抗體抗體的分子量為 180kd 對應 15 倍的吖啶酯。如果用戶的待標記樣品是其他的分子量,請參考附表 1 改變試劑的配比。

1.取 10 µL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml),加入 90 µL 無水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍,配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。

2.使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀釋 50µg 的抗體至 300 µL,加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)(參考附表 1)。

3.錫箔紙包好,室溫標記0.5~1h。

4.淬滅反應,加入 100 µL 標記終止緩沖液,室溫混勻 30 分鐘(注:如果標記較充分,也可以跳過此步驟,直接進行柱純化)。

5.  脫鹽柱純化,收集吖啶標記蛋白組分并檢測濃度,請參考說明書后文。

6.  檢測標記的蛋白,取10µL吖啶標記蛋白,放于黑色96孔板中,向每個微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯發光液,立即檢測,如果發光過強,可以對標記蛋白再進行若干倍的稀釋,使其在儀器的發光檢測限內。注:吖啶酯發光液最好現用現配,或者將NaOH溶液和過氧化氫溶液分別配成2x母液,使用的時候再11進行混合。

7.  吖啶酯標記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲(注意補加疊氮鈉等防腐劑),如果儲存效果不佳,則請避光保存于-20℃或者-80℃。

德晟是國內專門生產吖啶酯的廠家,質量和產量都受到好評。德晟研發生產的一共有6種不同基團的吖啶酯產品,包括:NSP-DMAE-NHS、DMAE-NHS、NSP-SA、NSP-SA-NHS、ME-DMAE-NHS、NSP-SA-ADH,品質非??煽?,客戶滿意度很高,歡迎前來選購。

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