發光標記物吖啶酯（NSP-SA-NHS）如何標記抗體

吖啶酯（NSP-SA-NHS），Cas199293-83-9及其相關化合物已被證明是非常有優勢的化學發光標記物，其穩定性、活性和敏感性超過了某些放射性同位素。吖啶酯能與含有一級氨基的蛋白發生反應。在堿性條件下，NHS作為離去基團被取代，蛋白質與吖啶酯形成穩定的酰胺鍵。反應完成后，多余的吖啶鹽通過脫鹽柱除去，下面介紹下NSP-SA-NHS使用說明（舉例抗體/蛋白質標記）。

1.配制   

標記緩沖液：0.2M NaHCO3  (pH=9.0)；

標記終止緩沖液：10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液；

脫鹽純化緩沖液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5)；

吖啶酯發光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

2. 計算標記所用抗體（蛋白質）和吖啶酯的量：

通常設定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具體需根據氨基酸組分進行摸索調整；

配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；

使用0.2M NaHCO3（pH=9.0） 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應液 。

3. 連接及純化

本說明書舉例針對標記抗體抗體的分子量為 180kd 對應 15 倍的吖啶酯。如果用戶的待標記樣品是其他的分子量，請參考附表 1 改變試劑的配比。

1．取 10 µL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 µL 無水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。

2．使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀釋 50µg 的抗體至 300 µL，加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)（參考附表 1）。

3．錫箔紙包好，室溫標記0.5~1h。

4．淬滅反應，加入 100 µL 標記終止緩沖液，室溫混勻 30 分鐘（注：如果標記較充分，也可以跳過此步驟，直接進行柱純化）。

5.  脫鹽柱純化，收集吖啶標記蛋白組分并檢測濃度，請參考說明書后文。

6.  檢測標記的蛋白，取10µL吖啶標記蛋白，放于黑色96孔板中，向每個微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯發光液，立即檢測，如果發光過強，可以對標記蛋白再進行若干倍的稀釋，使其在儀器的發光檢測限內。注：吖啶酯發光液最好現用現配，或者將NaOH溶液和過氧化氫溶液分別配成2x母液，使用的時候再1：1進行混合。

7.  吖啶酯標記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲（注意補加疊氮鈉等防腐劑），如果儲存效果不佳，則請避光保存于-20℃或者-80℃。

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